摘要：目的 观察豚鼠及大鼠对注射用灯盏花素诱导的主动全身过敏反应（ASA）的表现，增加与过敏反应相关指标的检测，探索从多层次、多方面评价中药注射剂潜在的过敏性。方法 将Hartley豚鼠及BN大鼠分别随机分为卵蛋白（OVA）组、注射用灯盏花素组、阴性对照组，给予相应的药物或生理盐水，进行ASA实验，观察药物激发后30 min动物ASA。取肺组织HE染色观察病理改变。采用放免法检测BN大鼠在致敏前、致敏第18日以及激发后血清总IgE水平的变化。结果 对Hartley豚鼠或BN大鼠，OVA组均呈现阳性过敏反应症状，注射用灯盏花素组则为阴性。肺组织病理切片显示，OVA组或灯盏花素组肺组织血管周围均有明显淋巴细胞浸润等免疫病理表现。与阴性对照组或药物致敏前比较，OVA组或灯盏花素组大鼠给药后血清总IgE水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论 增加不同品种动物及指标，能更全面评价注射用灯盏花素的潜在致敏性。
关键词：注射用灯盏花素；主动全身过敏反应；Hartley豚鼠；BN大鼠；总免疫球蛋白E
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0030-03
注射用灯盏花素（以下简称“灯盏花素”）是菊科短葶飞蓬属植物灯盏细辛中提取的有效成分，临床主要用于治疗心脑血管病。其不良反应报道以过敏反应为主，严重的可出现过敏性
休克[1]。本研究选用Hartley豚鼠与BN大鼠，对灯盏花素诱导的主动全身过敏反应（active systemic anaphylaxis，ASA）进行比较研究，探索用不同品种的实验动物建立中药注射剂过敏反应动物模型，为完善中药注射剂过敏性评价提供实验依据。
1 实验材料
1.1 药物
卵蛋白（OVA），美国Sigma产品，购于北京鼎国生物技术有限责任公司，批号DHO15-4。灯盏花素，昆明龙津药业有限公司生产，批号20100711，规格：10 mg/支。Al（OH）3凝胶佐剂（alum adjuvant），美国Sigma产品，批号MDBH714。
1.2 动物
Hartley豚鼠，清洁级，雌雄各半，体质量250～300 g，北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2006- 2009。BN大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量160～180 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2003-0002。所有动物饲养于上海中医药大学实验动物中心，清洁级环境。
1.3 仪器
2-16K低温冷冻离心机，美国Sigma公司；MK3酶标仪，热电上海仪器有限公司；DK-8A电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；SN-695型放射免疫γ测量仪，上海核所日环光电仪器有限公司；DDL-5低速冷冻多管离心机，上海安亭科学仪器厂；ZT-Ⅱ型微型台式真空泵，绍兴卫星医疗设备制造有限公司；OLYMPUS BH-2光学显微镜，奥林巴斯光学株式会社；BX51正置显微镜，奥林巴斯光学株式会社。
1.4 试剂及配制
大鼠IgE标准品、抗大鼠IgE抗血清、125I-IgE（大鼠）标记物、RIA分析缓冲液均由复旦大学放射医学研究所制备。参考文献[2]配制致敏、激发药液。OVA致敏液：称取OVA 40 mg，加0.9%氯化钠注射用水2 mL溶解后，再与Al（OH）3凝胶佐剂2 mL充分混合，配成10 mg/mL浓度。激发液：称取OVA 60 mg，加0.9%氯化钠注射用水3 mL溶解，配成20 mg/mL浓度。致敏剂量5 mg/只，激发剂量10 mg/只。灯盏花素致敏液：药物配制、致敏以及激发剂量均同上。
2 实验方法
2.1 Hartley豚鼠主动全身过敏反应实验
取健康Hartley豚鼠，称重，随机分为灯盏花素组、OVA组、阴性对照组，每组6只。于致敏第1、3、5日，灯盏花素组及OVA组按致敏剂量分别皮下注射给药0.5 mL/只，阴性对照组皮下注射等容量生理盐水，隔日1次，共致敏3次。致敏第19日，各组动物分别静脉注射相应激发剂量的药物0.5 mL/只进行激发。观察动物注射后即刻至30 min内全身过敏反应情况。并根据全身致敏性评价标准分级[2]。“-”：过敏反应阴性（正常）；“+”：过敏反应弱阳性（躁动、竖毛、颤抖、搔鼻）；“++”：过敏反应阳性（喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪）；“+++”：过敏反应强阳性（呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转、潮式呼吸）；“++++”：过敏反应极强阳性（死亡）。
上述观察结束后取豚鼠右肺组织固定于10%甲醛溶液中，浸蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察并显微照相。病理改变评价标准参考文献[3]。“-”：肺组织未见明显病变；“+”：肺间质有少量炎症细胞，支气管黏膜下腺体轻度扩张；“++”：肺间质有较多的炎症细胞浸润，肺泡壁毛细血管轻度扩张瘀血，支气管间质有较多的炎症细胞浸润，支气管腔内有渗出物；“+++”：肺间质有大量炎症细胞浸润，肺泡壁毛细血管扩张淤血程度明显，支气管腔内有渗出物明显。
2.2 BN大鼠主动全身过敏反应实验
动物分组、给药、症状观察以及组织取材均同豚鼠实验。
2.3 BN大鼠血清总IgE水平检测
在上述BN大鼠进行ASA试验的同时，分别于致敏第0、18日，眼眶取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃冻存备用。致敏第19日进行激发，激发后30 min，BN大鼠以25%乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃保存备用。
按表1进行加样，充分混匀后4 ℃放置过夜，次日，每管加入0.5 mL分离剂，常温下放置20 min， 3 000 r/min离心20 min，吸去上清液，用放射免疫γ测量仪测量沉淀中每分钟的放射性计数（CPM）。以总IgE各标准点浓度的对数浓度（Log ng/mL）作为横坐标，对应的B/B0值为纵坐标作图，在半对数坐标纸上建立IgE浓度的标准曲线，可根据标准曲线方程中的B/B0值计算出被测量样品的总IgE浓度（ng/mL）。
3 统计学方法
应用SPSS11.5统计软件，计量资料以—x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD方法分析，方差不齐时采用非参数检验方法分析。过敏反应发生率采用卡方检验，过敏反应程度以及组织病理改变程度比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 灯盏花素对Hartley豚鼠主动全身过敏反应的影响
4.1.1 Hartley豚鼠过敏症状 结果显示：阴性对照组无异常表现；OVA组豚鼠均表现出呼吸急促等过敏反应症状，反应强度为强阳性，反应发生率为100%；灯盏花素组豚鼠则无异常表现。见表2。
4.1.2 Hartley豚鼠肺组织病理形态 结果显示：阴性对照组未见明显异常；OVA或灯盏花素组肺组织及支气管均可以观察到明显的病变，病变阳性率为100%。见表3。
4.2 灯盏花素对BN大鼠主动全身过敏反应的影响
4.2.1 BN大鼠过敏症状 结果显示：阴性对照组无异常表现；OVA组大鼠均表现出活动减少、四肢紫绀等过敏反应症状，反应强度为强阳性，反应发生率为100%；灯盏花素组大鼠未见异常表现。见表4。
4.2.2 BN大鼠肺组织病理形态 结果显示：阴性对照组未见明显异常；OVA或灯盏花素组肺组织及支气管均可以观察到明显的病变，病变阳性率为100%。见表5。
4.2.3 灯盏花素对BN大鼠血清总IgE水平的影响 结果显示：与阴性对照组相比，致敏第18日与激发后，OVA与灯盏花素组血清总IgE水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）与同组致敏第0日相比，致敏第18日与激发后，2组血清总IgE水平亦显著升高（P<0.05或P<0.01）。见表6。
5 讨论
《中药、天然药物免疫毒性研究的技术指导原则》[2]中规定，药物过敏反应检测应进行豚鼠ASA。观察指标主要为整体反应症状，以此来判断过敏反应及其程度。许多中药注射剂上市之前均进行过临床前过敏方面安全性评价，但在临床使用中却出现过敏反应的报道，这与中药注射剂具有多成分、成分又复杂的特点有关。基于已知不同遗传背景的动物对不同成分的过敏反应不同[4]，以过敏反应的原理分析仅选用豚鼠进行ASA实验来评价中药注射剂的致敏性可能存在一定的不足。
BN大鼠为褐色近交系挪威大鼠，由于高IgE表达和Th2型反应的倾向性，易于诱导Ⅰ型超敏反应，为研究食物致速发型超敏反应的适宜动物模型。郭氏等[3]利用BN大鼠对清开灵注射剂等中药注射剂的过敏性进行研究，检测出明显的过敏反应，提示BN大鼠可以作为中药过敏反应研究的适宜动物模型[5-6]。
本研究采用Hartley豚鼠与BN大鼠进行ASA实验，以进一步论证选用BN大鼠的可行性及特点。结果表明，阳性药对Hartley豚鼠或BN大鼠整体症状均表现为阳性过敏反应，灯盏花素对二者则未表现出明显的全身过敏反应症状，反应几近一致。有文献报道对动物过敏反应表现评价有多方面，在过敏性哮喘动物模型中，除整体表现观察到哮喘症状外，还会在肺组织病理改变中出现一些炎症病变[7-9]。因此本研究对动物的肺组织进行组织病理检查，结果表明，致敏激发后Hartley豚鼠或BN大鼠的肺部在阳性药及灯盏花素均能观察到肺部明显的炎症病理改变，其病变率和病变程度相似，而这些病理学的改变与文献报道Ⅰ型过敏反应的免疫病理改变是相符合的[7-9]。
此外，本研究对BN大鼠进行了总IgE水平的检测，结果表明，在未致敏状态下，各组动物血清总IgE水平无差异，致敏与激发后，与阴性对照组相比，阳性药与灯盏花素血清总IgE水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。一般认为，IgE是一种与Ⅰ型变态反应有关的免疫球蛋白。当致敏原首次进入体内后，刺激B淋巴细胞产生IgE，血清IgE水平明显增高，机体处于致敏阶段。当致敏原再次进入机体后，激发肥大细胞脱颗粒，产生组胺等过敏介质从而造成机体发生Ⅰ型超敏反应。因此血清总IgE水平升高一般认为可出现于过敏性疾病[10-12]。与致敏阶段相比，激发后由于抗原抗体发生反应，因此总IgE水平比激发前有所降低，但仍高于致敏前，本研究结果与文献报道一致[13]。BN大鼠不同时点总IgE水平变化符合Ⅰ型超敏反应总IgE水平的变化，且与病理形态学改变相一致，这个变化与阳性药OVA是一致的。虽然整体表现无异常，但仍可反映出灯盏花素潜在的过敏反应性。
本研究探索用不同品种的实验动物，对BN大鼠作为过敏反应的试验动物可行性作了进一步论证。在实验中增加检测与过敏反应相关的指标，以提高中药注射剂过敏反应评价的灵敏性，为多层次评价中药注射剂潜在致敏性的研究模式提供了试验依据。今后将用此方法对更多的中药注射剂进行研究，以期进一步验证该方法的可靠性与灵敏性。
参考文献：
[1] 谢冬梅，马玲.灯盏花素注射液的不良反应文献分析[J].中国实用医药， 2009，4（15）：65-67.
[2] 国家食品药品监督管理局.中药、天然药物免疫毒性研究的技术指导原则[S].2005：9.
[3] 郭姗姗，王意忠，张毅，等.BN大鼠和豚鼠评价双黄连注射液的过敏反应[J].中国药理学与毒理学杂志，2009，23（2）：128-133.
[4] Hylkema MN， Hoekstra MO， Luinge M， et al. The strength of the OVA-induced airway inflammation in rats is strain dependent[J]. Clin Exp Immunol，2002，129（3）：390-396.
[5] Dong CC， Yin XJ， Ma JY， et al. Exposure of brown Norway rats to diesel exhaust particles prior to ovalbumin （OVA） sensitization elicits IgE adjuvant activity but attenuates OVA-induced airway inflammation[J]. Toxicol Sci，2005，88（1）：150-160.
[6] Knippels LM， Penninks AH， Smit JJ， et al. Immune-mediated effects upon oral challenge of ovalbumin-sensitized Brown Norway rats：further characterization of a rat food allergy model[J]. Toxicol Appl Pharmacol，1999，156（3）：161-169.
[7] Fischer R， McGhee JR， Vu HL， et al. Oral and nasal sensitization promote distinct immune responses and lung reactivity in a mouse model of peanut allergy[J]. Am J Pathol，2005，167（6）：1621-1630.
[8] 郭姗姗，王意忠，张毅，等.BN大鼠和豚鼠对清开灵注射液致速发型过敏反应的比较[J].药学学报，2009，44（8）：852-857.
[9] 谢柏梅，范亮.地塞米松对豚鼠哮喘模型肥大细胞和类胰蛋白酶的影响[J].陕西医学杂志，2008，37（1）：13-16.
[8] Weaver JL， Staten D， Swann J. Detection of systemic hypersensitivity to drugs using standard guinea pig assays[J]. Toxicology，2003，193：203-217.
[10] Plebani M. Clinical value and measurement of specific IgE[J]. Clin Biochem，2003，36（6）：453-469.
[11] Jujo K， Renz H， Abe J， et al. Decreased interferom gamma and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes IgE synthesis[J]. J Allergy Clin Immunol，1992，90（3）：323-331.
[12] 陈谱.变态反应性疾病中肥大细胞的特异性激活标志物[J].实用儿科临床杂志，2004，19（2）：141-143.
[13] Lewkowich IP， Rempel JD， Hayglass KT. In vivo IgE levels in exogenous antigen stimulated responses：measurement of total IgE as a valid， simple surrogate for Ag-specific IgE[J]. J Immunol Methods，2004，286（1/2）：123-132.
（收稿日期：2011-09-11，编辑：华强）