摘 要 以文心兰试管苗为材料，采用RT-PCR结合RACE法，克隆文心兰OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列。结果表明：COBRA全长为1 601 bp，开放阅读框（ORF）为1 386 bp，共编码461个氨基酸；OnCOBRA的DNA序列共2 949 bp，且含有6个外显子和5个内含子。生物信息学结果表明，OnCOBRA属于不稳定的疏水蛋白，具有信号肽、跨膜结构和CCVS保守区域，亚细胞定位于细胞膜中；与无油樟、玉米、籼稻、拟南芥等具有较高的同源性。系统进化树分析结果表明，文心兰OnCOBRA蛋白与玉米（ZmCOBRA）、无油樟（AtCOBRA）、籼稻（OsCOBRA）处于统一分枝，推测OnCOBRA基因是COBRA基因家族的成员。qPCR结果表明，OnCORBA为组成型表达，在成苗期表达量最高，在文心兰类原球茎时期表达量最低。
关键词 文心兰；COBRA；克隆；生物信息学；qPCR
中图分类号 S682.31 文献标识码 A
Molecular Cloning and Expression Pattern
of OnCOBRA Gene in Oncidium
LI Ling， LAI Zhongxiong*， CHEN Yukun， LIAN Conglong， LIN Heyan
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002 China
Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to clone the complete cDNA sequences and DNA sequences of OnCOBRA from Oncidium vitro plant. The complete cDNA sequence of OnCOBRA was 1 601 bp， encoding 461 amino acids， the DNA sequence of OnCOBRA was 2 949 bp which had 6 exons and 5 introns. The sequences of nucleotides of OnCOBRA and amino acids of OnCOBRA was high homologous with those of the known COBRA genes in other species. OnCOBRA located in plasma membrane， which had a signal peptide， transmembrane structure and CCVS protein domain. Phylogenetic tree of COBRA in plants indicated that OnCOBRA， ZmCOBRA， AtCOBRA， and OsCOBRA belonged to the same branch， and It putatively belonged to COBRA family. qPCR results indicated that OnCOBRA was constitutive expression and showed approximately a inverted“V”curve， it expressed at the highest levels in the seedings and the lowest levels in the PLB.
Key words Oncidium；COBRA；Clone；Bioinformatics；qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.018
文心兰属兰科文心兰属植物，植株轻巧、花茎轻盈下垂、花朵奇异可爱且色彩鲜艳，故又名跳舞兰、金碟兰、舞女兰等，是世界上重要的盆花和切花种类之一。
COBR基因首先是在分析拟南芥的根发育过程中发现，存在于细胞异常膨胀的突变体中[1]。COBRA基因编码一种糖磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphatidyl inositol-anchored protein，GPI）锚定蛋白，控制细胞壁纤维素微纤丝的正确定位和细胞的定向伸长[1-3]，同时伴随着纤维素含量的减少和纤维素不同方向的排列[4]。糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物，是一类细胞表面蛋白[5]。在动物细胞中这种脂质链接用来定位极性蛋白，且研究较为广[6]。在植物细胞中，最近十几年才开始研究，它作用于植物细胞膜外表面，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接，能感知细胞壁相关信息并传导到细胞膜上。植物的生长发育与细胞壁有着密切的关系，如植物的形态建成、器官组织的机械强度及果实成熟软化等[7]。最新研究结果发现，COBRA家族的某些基因与花粉管的伸长方向也有一定关系[8]。而COBRA的突变体则缺失相关功能，如拟南芥COB-5的突变体与COB-5野生型相比细胞伸长率下降[9]；水稻的bc-1突变体使得细胞壁的纤维素减少而木质素增加，从而控制单子叶植物组织的机械强度[10]；玉米的bk2-ref的突变体造成细胞次生壁不均匀增厚，而使玉米茎杆的机械强度降低[11]。由于COBRA基因具有高度的保守性，通过比较不同物种COBRA基因核苷酸或氨基酸序列的异同，可对物种进行分类和建立各物种之间的系统发育关系。迄今为止，从许多高等植物如拟南芥[1， 8]、番茄[7]、陆地棉[12]、水稻[4]、玉米[11]等克隆到了COBRA基因，但有关兰科植物的COBRA基因的功能研究尚未见报道。本研究利用文心兰试管苗分离克隆了OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列，并通过qPCR法研究其在文心兰生长发育过程中的表达规律，探索OnCOBRA基因在文心兰试管苗生根过程中的分子机制，对有效提高文心兰移栽的成活率具有重要的经济意义。相关研究已报道了COBRA基因与果实成熟有密切关系，本研究将继续探讨与鲜花衰败是否有一定联系。