材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）购于中国农业微生物菌种保藏中心。
1.1.2培养基马铃薯琼脂培养基（原配方以无菌水进行 3 ∶1稀释，以调整其硬度和降低营养物浓度）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，补足蒸馏水至1 L。
1.1.3主要试剂和仪器“U”形玻璃棒，whatman 滤纸（孔径10 μm，英国），凹玻片，盖玻片，玻璃点样毛细管（长度100 mm；内径0.3 mm，华西医科大学），玻璃涂布器，直径9 cm 漏斗，乳酸石碳酸棉兰染色液，漩涡振荡器，擦镜纸（湿热灭菌后烘干备用），20% 灭菌甘油，0.05% Tween-80 无菌水，Nikon- ECLIPSE -50i 光学拍照显微镜（日本）。
1.2方法
1.2.1单孢子分离方法准备工作：用75%乙醇溶液擦拭漩涡振荡器、光学显微镜等，超净工作台内紫外杀菌30 min。拟青霉培养7 d，加5 mL无菌水于培养皿中，用涂布器刮下平板表面菌落。用孔径10 μm的 whatman 滤纸过滤 2 次得孢子悬液。加入95 mL 0.05% Tween-80无菌水和 20个直径5 mm的玻璃珠，放在漩涡振荡器充分振荡10 min[8]。孢子溶液用0.05% Tween-80无菌水梯度稀释至浓度约为10万～30万个/mL（血细胞计数板每大格约1 个孢子）。将毛细管放于三角瓶中，待液面升至毛细管3/4时，拿出轻轻点样于凹玻片的凹槽中央，然后加盖盖玻片。用低倍镜观察，只保留单孢子液滴的凹玻片，其余的用擦镜纸擦去后重新点样。
1.2.2单菌落获取和生长形态观察方法准备湿室：培养皿内铺1张圆形滤纸，然后放置 “U”形玻璃棒，棒上面放置1块凹玻片（凹面向上），盖上皿盖，外用纸包扎，121 ℃湿热灭菌30 min，然后置于100 ℃烘箱中烘干。冷却后每皿加入 5～7 mL 20%的灭菌甘油保湿。融化培养基：将试管中稀释好的PDA固体培养基加热融化后放于55 ℃水浴锅中保温、待用。覆盖培养基：吸取100 μL 55 ℃的培养基，迅速滴入已分离到单孢子的凹槽中，快速转动使其平整。培养：28 ℃恒温培养。观察：既定时间拿出，乳酸石碳酸棉兰染色液染色，光学显微镜下拍照观察，必要时可加盖玻片后用油镜观察。
2结果与分析
单孢子分离结果见图1。
单菌落获取结果见图2。
每隔一定时间从培养箱中拿出凹玻片，放于显微镜下拍照。图3：萌发的分生孢子；图4：分生孢子长出菌丝体；图5：形成密集的菌丝体；图6：菌落中心开始产生分生孢子；图7：
菌落边缘还未产生分生孢子；图8：菌落边缘产生大量分生孢子。
3结论和讨论
单纯自然形态观察时，可省去单孢子分离的步骤，毛细管点样后直接覆盖培养基即可；此法对产生孢子的放线菌同样适用；如孢子直径较小，应使用40倍的物镜观察分离；梯度稀释后，显微镜下如有多个孢子，可用灭菌的针或牙签挑去多余孢子；若没有whatman滤纸，可用4层擦镜纸替代。
本方法的创新之处：仅用凹玻片和常规的光学显微镜就能很容易分离到单孢子；不须要制备专门的毛细滴管，使用市售的玻璃点样毛细管即可；加盖盖玻片可有效防止液滴干燥，使操作时间延长到3 min以上；通过孔径10 μm的whatman滤纸过滤，可得纯净的孢子悬液，几乎无菌丝体残留；凹玻片的凹槽加入适量培养基不会外漏，且加入的培养基较薄，便于观察；用20%甘油保湿，效果明显优于水琼脂；能随时观察真菌、放线菌的自然生长状态。
该单孢子分离方法不需要特殊分离仪器，一般实验室均能采用，很易观察到不同生长期霉菌、放线菌不同层次上的自然生长状态，可在实验室中推广使用。
参考文献：
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