【摘要】研究丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法 利用培养的新生大鼠心肌细胞造成缺血再灌注损伤模型，CCK-8检测细胞增殖，BD流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果：在不同剂量的丹参酮ⅡA干预缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞模型后，细胞活性明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡结果显示，与Control 组相比，I/R组心肌细胞凋亡显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），丹参酮ⅡA高低中剂量组心肌细胞凋亡显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 丹参酮ⅡA可以有效保护缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞的损伤。
【关键词】丹参酮ⅡA、缺血再灌注损伤、心肌细胞
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.20..02
心肌缺血：再灌注损伤是缺血性心脏病临床治疗中最常见的一种病理损害，最近基础研究和临床研究显示，心肌细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤（I/R）的联系十分密切，可能是心肌缺血/再灌注损伤发病机制中的重要环节之一。伴随缺血性心脏病的高发，如何预防或减轻心肌缺血/再灌注损伤已成为研究热点。丹参酮ⅡA来源于唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，是一种脂溶性物质，桔红色针状结晶，具有药理作用广泛、副作用小和价格低等优点。本实验从细胞水平进一步研究丹参酮ⅡA对心肌缺血再灌注损伤的作用机制，为治疗心肌缺血再灌注损伤的提供新的依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
SD乳鼠（由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供），DMEM 培养基、胎牛血清FBS（hyclone公司）；胰蛋白酶、青链霉素双抗溶液（碧云天）；Ⅱ型胶原酶、牛血清白蛋白BSA（Invirtogen 公司）；cck-8检测试剂盒（日本同仁化学）；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基）；丹参酮ⅡA（南京景竹医药）
1.2 方法
（1）心肌细胞缺血再灌注损伤模型
无菌条件下取SD 乳鼠取心脏，去心包膜及心房，取心室肌，Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化，差速贴壁法获得大鼠原代心肌细胞，接种于含10% FBS 和100 mg/L青链霉素双抗的DMEM 培养基，37℃、5% CO2培养约48 h，待增殖良好，进行I/R模型建立。缺血液使用不含胎牛血清、不含糖的DMEM培养基。首先将缺血液用混合气体（5%CO2和95%N2）平衡2 h以上饱和缺血液，换掉心肌细胞的正常培养液，将饱和过的缺血液迅加入细胞培养，然后将处理完的心肌细胞放置在37C°低氧培养箱（5%CO2和95%N2）中缺氧培养12 h。心肌细胞缺血12 h后，用移液器将缺氧液吸掉，置换上DMEM培养基（含糖、含10% FBS），将用正常培养液的心肌细胞放置在37C°的培养箱（95%空气和5%CO2）中，继续培养2 h，建立I/R心肌细胞模型。实验分为正常心肌细胞组，I/R模型组，丹参酮ⅡA高中低剂量组（2.5 μM，10 μM，40 μM）；
（2）胰蛋白酶消化心肌细胞，制备细胞悬液接种到96孔板中，每孔约100ul细胞悬液，按照各组培养方法进行培养，I/R心肌细胞模型建立后24小时丹参酮ⅡA高中低剂量组分别加入丹参酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM，细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，加入10 ul CCK8。培养2 h。测定450 nm吸光度。
（3）I/R心肌细胞模型建立后24 h，丹参酮ⅡA高中低剂量组分别加入丹参酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM。胰蛋白酶消化各组心肌细胞，离心收集后经冷PBS洗涤细胞2次，加入1×结合缓冲液（binding buffer），制成终浓度约为1×109/L的细胞悬液500 μl.向细胞悬液中先加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，温和混匀，4℃避光反应15 min，再加入
5 μl PI，温和混匀，4℃避光孵育5 min，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件对研究结果进行分析，计数资料采用百分数（%）表示，例（n）表示，采用x2检验，计量数据以“x±s”表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
（1）丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞细胞增殖的影响，见表1。CCK-8结果显示与模型组比较，丹参酮ⅡA组细胞存活率增加，10 μM，40 μM丹参酮ⅡA组细胞存活率明显增加（P<0.05）。
（2）丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞细胞凋亡的影响，见图1。细胞经I/R 处理后，与Control 组相比，I/R组心肌细胞凋亡显著增加（P<0.05）。I/R细胞模型经过丹参酮ⅡA高中低剂量干预后，进一步探讨丹参酮ⅡA对心肌细胞凋亡的影响。结果显示，与I/R 组相比，丹参酮ⅡA高低中剂量组心肌细胞凋亡显著减少（P<0.05），并且呈现一定的量效关系。
3 讨 论
研究表明，缺血性心脏病已成为现如今严重威胁人类身体健康和生命安全的重大疾病之一，最直接有效的治疗方法之一是迅速恢复缺血部位的血流灌注 [1].心肌缺血再灌注损伤是常用治疗如冠状动脉内溶栓、动脉搭桥以及导管介入治疗频发的严重并发症，缺乏有效的防治途径。阻碍缺血心肌从再灌注治疗中最大难题为心肌缺血再灌注损伤，从而无法取得最好疗效，怎样降低心肌缺血再灌注损伤已经成为缺血再灌注研究的一大热点[2]。
心肌缺血/ 再灌注损伤是一种多途径，多因素的病理生理进程，心肌细胞的坏死、凋亡以及自噬伴随整个过程[3]。研究表明，细胞凋亡参与心肌I /R损伤的病理生理过程，在由于心肌缺血早期而导致死亡的心肌细胞中，心肌细胞发生凋亡的数量甚至多于直接坏死细胞[4]。既往研究显示丹参酮ⅡA 对大鼠缺血性脑损伤具有保护作用，本实验研究通过大鼠心肌细胞体外培养并建立缺血再灌注模型，通过cck-8和流式细胞术探讨丹参酮ⅡA对缺血再灌注后心肌细胞的保护作用。实验结果显示，在不同劑量的丹参酮ⅡA干预缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞模型后，细胞活性明显增加（P<0.05）。细胞凋亡结果显示，与Control 组相比，I/R组心肌细胞凋亡显著增加（P<0.05），丹参酮ⅡA高低中剂量组心肌细胞凋亡显著减少（P<0.05）。丹参酮ⅡA 对心肌的保护作用随着其在心血系统的作用机制研究的不断深入，丹参酮ⅡA可能成为治疗缺血性心肌病的重要选择。
参考文献
[1]杨小利，张 骏，周 平，等.胃泌素通过STAT3 途径对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤发挥保护作用.第三军医大学学报，2015，37（9）：896-901.
[2]翟昌林，黎 莉，张 运，等.丹皮酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护中HMGB1表达的影响[J].中华中医药学刊，2012，10（30）：2284-2286.
[3]Xu J，Qin X，Cai X，et al.Mitochondrial JNK activation triggers autophagy and apoptosis and aggravates myocardial injury following ischemia/reperfusion.Biochim Biophys Acta，2015，1852（2）：262-270.
[4]田学峰，王晓云，梁 明，等.丹参酮IIA磺酸钠联合脑钠肽对急性缺血再灌注兔心肌细胞凋亡的影响[J].中国中医药科技，2013，20（6）：605-606.
本文编辑：李 豆