[摘要] 目的 探讨依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠PDCD-5蛋白表达的影响。 方法 将体重为250～280 g的健康雄性SD大鼠78只按照随机数字表法分为空白对照组（n = 6，生理盐水，3 mg/kg，2次/d，腹腔内注射）、假手术组（n = 24，生理盐水，3 mg/kg，2次/d，腹腔内注射）、脑缺血再灌注组（n = 24，生理盐水，3 mg/kg，2次/d，腹腔内注射）及药物干预组（n = 24，依达拉奉3 mg/kg，2次/d，腹腔内注射），后三组再随机分为6 h组、1 d组、3 d组、7 d组。选择改良Longa法建立脑缺血再灌注模型。比较各组神经功能缺损情况、脑梗死面积及PDCD-5和Caspase-3蛋白在不同时期海马组织中的表达。 结果 脑缺血再灌注组脑梗死灶较假手术组明显增加（P < 0.05），药物干预组脑梗死灶较脑缺血再灌注组明显减少（P < 0.05）。同时，不同时间点脑缺血再灌注组的PDCD-5、Caspase-3蛋白表達均高于假手术组和药物干预组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠海马组织中PDCD-5的表达起抑制作用，并对大鼠脑缺血再灌注损伤起脑保护作用。
[关键词] 脑缺血再灌注；PDCD-5；依达拉奉；大鼠
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0016-04
Study on the mechanism of Edaravone on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats
MI Yan1 GAO Xiaoping2 ZHU Qingfeng2 LUO Hailong3
1.Department of Electrophysiology， Hu′nan Thoracic Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China； 2.Department of Neurology， Hu′nan People′s Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China； 3.Department of Endoscopic Diagnosis， Hu′nan Thoracic Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of Edaravone on the expression of PDCD-5 protein in rats with cerebral ischemia reperfusion. Methods Seventy-eight healthy male SD rats with a healthy weight of 250-280 g were randomly divided into blank control group （n = 6， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection）， sham operation group （n = 24， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection）， cerebral ischemia reperfusion group （n = 24， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection） and drug intervention group （n = 24， Edaravone 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection） according to random number table method， and the latter 3 groups were randomly divided into 6 h group， 1 d group， 3 d group and 7 d group. A modified Longa method was used to establish cerebral ischemia-reperfusion model. The neurological deficit， the acreage of cerebral infarction and the expression of PDCD-5 and Caspase-3 protein in hippocampus of different periods were compared. Results The cerebral infarction in cerebral ischemia reperfusion group was significantly increased compared with sham operation group （P < 0.05）； the cerebral infarction in drug intervention group was significantly reduced compared with cerebral ischemia reperfusion group （P < 0.05）. At the same time， the expression of PDCD-5， Caspase-3 protein in cerebral ischemia-reperfusion group at different time points was higher than those in corresponding sham-operation group and corresponding drug intervention group （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can inhibit the expression of PDCD-5 in the hippocampus of rats with cerebral ischemia-reperfusion， and protect the brain against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.
[Key words] Cerebral ischemia reperfusion； PDCD-5； Edaravone； Rat
脑血管病以缺血性脑血管病居多，急性缺血性脑血管病约占所有脑血管病的80%[1]。脑缺血再灌注后脑组织的损伤机制很多，包括自由基释放[2]、钙泵破坏[3]、炎性反应[4]、细胞凋亡[5-6]等机制，而脑缺血再灌注损伤后神经元发生细胞凋亡对脑组织的损害起着重要作用，神经元凋亡与缺血的类型、严重程度、再灌注时间的长短有关。而依达拉奉是一种新型的自由基清除剂，具有抗细胞凋亡和神经保护作用。PDCD-5是我国从白血病株TF-1细胞中克隆得到的拥有自主知识产权的新功能基因，是细胞凋亡的正调节分子，能结合Caspase-3[7-8]。本研究旨在探究依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠PDCD-5和Caspase-3蛋白表达的影响，为临床缺血性脑血管病的防治寻找可能的新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选择10～12周龄、体重250～300 g的清洁级健康雄性SD大鼠78只，由湖南斯莱克景达实验有限公司提供，质量合格证号：SYXK（湘）2010-0013，大鼠置于室温在20～23℃的喂养室，每日定时喂食、换水，按自然昼夜生物节律活动。动物的使用符合伦理学要求（湖南省人民医院伦理委员会）。按照随机数字表法将其分为空白对照组（n = 6）、假手术组（n = 24）、脑缺血再灌注组（n = 24）及药物干预组（n = 24），后三组再随机分为6 h组、1 d组、3 d组、7 d组。
1.2 试剂
PDCD-5和Caspase-3的一抗由Proteintech Group（PTG）公司（美国，芝加哥）提供，货号分别为12456-1-AP和19677-1-AP。依达拉奉试剂由南京先声药业提供，批号：80-150409。
1.3 模型制备
本研究在Longa等[9]模型的基础上改进和完善，选择大鼠的颈总动脉入路。大鼠术前不禁水，不过要求禁食12 h，采用0.3 mL/100 g水合氯醛（10%）腹腔注射大鼠实施麻醉，大鼠正中右侧旁开0.5 cm行纵行切口，分离出右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA），然后分离大鼠动脉鞘，将迷走神经和CCA分开，并向上分离至分叉处，使大鼠颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）彻底分离，用两根备好的尼龙线结扎颈总动脉，近心端应结扎紧，远心端在线栓未插入之前不应结扎紧，并用微型动脉夹夹闭颈内动脉。此时在颈总动脉结扎尼龙线之间用眼科剪一大小约3 mm的小口。用眼科镊夹住线栓从颈总动脉切口往颈内动脉插入，当线栓插入18.5（±0.5）mm。此时结扎颈总动脉远端的尼龙线以固定线栓，将栓线尾端剪断并留大概10 mm漏出大鼠皮肤表面，然后缝合大鼠筋膜和皮肤。接着给大鼠局部使用庆大霉素预防伤口感染，术后将大鼠置于空调房保暖。待栓线栓塞2 h后再实施灌注，将栓线拔出至CCA的远端结扎线处，剪断血管外的栓线。术后大鼠分笼饲养。
1.4 实验分组
正常对照组不做任何处理。假手术组模型制作过程与实验组相同，栓线仅进入颈内动脉10 mm，并于2 h后再实施灌注。药物干预组制备过程与脑缺血再灌注组一样，只是造模后立即予以依达拉奉注射液（按3 mg/kg腹腔注射）干预，而假手术组、脑缺血再灌注组及空白对照组予以相同剂量的生理盐水干预。
1.5 神经功能缺损评分
参考Longa等[9]5分制评分标准进行神经功能评定。0分：无神经损伤体征；1分：提鼠尾时不能完全伸展左侧前爪；2分：行走时大鼠身体向左侧转圈；3分：行走时大鼠身体向左侧倾倒；4分：无自发活动或伴有意识丧失。评分越高表明神经功能缺损越严重。大鼠的神经功能评分由两人共同完成，消除主观因素。0分和4分予以剔除，术中及术后动物死亡或取材时发现有蛛网膜下腔出血均视为造模失败，予以删除样本，并从同批次的大鼠中随机补充。
1.6 TTC染色
将大鼠于实验组对应的结束时间点处死，断头取脑，观察鼠脑大体形态，去除小脑和脑干，置于0～4℃的生理盐水中10 min，自后向前进行2 mm厚的冠状切片，置2% TTC/磷酸缓冲液中，37℃避光孵育30 min，后置4%多聚甲醛/PBS中固定6 h，观察脑梗死灶呈色情况，正常脑组织呈红色，梗死的脑组织呈白色。
1.7 PDCD-5和Caspase-3蛋白的表达
采用Western blot方法检测大鼠海马区PDCD-5蛋白和Caspase-3蛋白的表達（内参为GAPDH），所有的操作步骤都是按试剂盒的方法和步骤来完成。阳性条带采用Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件分析，检测累积光密度（IOD）参考值。
1.8 统计学方法
采用SPSS 19.0统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组计量资料采用两样本t检验，多组间计量资料采用方差分析，多组间差异有统计学意义后采用SNK-q检验进行两两间的比较，方差不齐则采用非参数检验LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 神经功能缺损评分
2.1.1 各组神经功能缺损评分分布情况 脑缺血再灌注组和药物干预组的神经功能评分为0分及4分的大鼠已被剔除，从同批次的大鼠中随机补充。各组神经功能缺损评分分布见表1。
2.1.2 各组神经功能缺损评分比较 假手术组神经功能缺损评分为0分，脑缺血再灌注组为（2.13±0.68）分，药物干预组为（1.58±0.65）分，其中脑缺血再灌注组神经功能缺损评分高于假手术组（P < 0.05），药物干预组神经功能缺损评分低于脑缺血再灌注组（P < 0.05）。
2.2 TTC染色
各组脑组织TTC染色结果显示，空白对照组与假手术组未见梗死灶，脑缺血再灌注组与药物干预组均可见明显的梗死，见图1。药物干预组脑梗死面积[（27.02±1.75）mm2]较脑缺血再灌注组[（32.61±2.11）mm2]明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 PDCD-5蛋白表达
各时间点不同组的PDCD-5蛋白表达如图2、表2所示，不同时间点脑缺血再灌注组、药物干预组的PDCD-5蛋白表达均高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）；不同时间点药物干预组的PDCD-5蛋白表达均明显低于脑缺血再灌注组，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 Caspase-3蛋白表达
各时间点不同组的Caspase-3蛋白表达如图3、表3所示，不同时间点脑缺血再灌注组、药物干预组的Caspase-3蛋白表达均明显高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）；不同时间点药物干预组Caspase-3蛋白表达均明显低于脑缺血再灌注组，差异有统计学意义（P < 0.05）。
3 讨论
PDCD-5是我国从白血病株TF-1细胞中克隆得到的拥有自主知识产权的新功能基因，PDCD-5的研究目前涉及肿瘤、风湿免疫系统疾病、血液系统疾病和心脑血管疾病[10-12]。PDCD5是一种十分重要的正调基因[13]。机体受到各种刺激时，在不同类型细胞中的PDCD-5可加速细胞凋亡，并且通过调控细胞凋亡从而实现不同疾病类型的监控功能[14]。细胞凋亡通路主要包括线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路[15]，而且三者都与Caspase家族有关。Caspase-3是Caspase家族非常重要的一种凋亡执行者，是细胞凋亡过程中的主要效应因子之一。细胞凋亡进入不可逆阶段的标志之一就是Caspase-3的活化。PDCD-5是细胞凋亡的正调节分子，通过和Caspase-3的结合，PDCD-5通过直接或间接途径促进Caspase-3的凋亡效应[16-17]。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase），Caspase包括凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子三大类，从而形成级联放大效应，活化Caspase可以发挥降解细胞功能蛋白和结构蛋白的作用，从而引起细胞凋亡；而细胞凋亡过程的关键酶之一就是Caspase-3[17]。因此机体PDCD-5通过结合Caspase-3可以实现Caspase-3的正调节效应。
研究表明摧毁PDCD5基因的小鼠大脑中动脉闭塞模型与野生型小鼠相比有更好的大脑微循环保护模式[18]。本研究结果显示，药物干预组PDCD-5和Caspase-3明显低于脑缺血再灌注组，而且脑梗死面积及神经功能缺损评分同样明显低于脑缺血再灌注组。本研究结果提示，依达拉奉可以抑制PDCD-5的表达，这与Caspase-3密切相关，从而发挥脑保护的作用，但是通过何种途径尚未得到证实。研究证实，PDCD-5是一种细胞凋亡正调控基因，并且调控过程中与细胞色素C密切相关[19-20]，而线粒体/细胞色素C通路是细胞凋亡的重要通路，可激活Caspase-3而引发细胞凋亡。
综上所述，依达拉奉可能因为减少了机体PDCD-5的表达，进而抑制细胞色素C结合Caspase-3调控的细胞凋亡通路及信号转导，从而抑制机体缺血再灌注损伤。
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（收稿日期：2018-06-12 本文編辑：张瑜杰）