棉花T-DNA标签雄性不育突变体的遗传分析

摘 要:利用农杆菌介导T-DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1∶1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T-DNA插入共分离,从而认为突变是由T-DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T-DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。

关键词:棉花;T-DNA;雄性不育突变体;遗传分析

中图分类号:S562.035.3文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)01-0022-04

Genetic Analysis of Cotton Male Sterile Mutant by T-DNA Tagging

ZHANG YU-qin1,2, GAO Jun-ping2, ZHANG Jin3,WANG Fu-rong2,ZHANG Jun2

(1.College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014,China;2.Shandong Subcenter of National Cotton Genetic Improvement Center of P.R.China/Shandong Cotton Research Center, Jinan 250100,China;3.College of Life Science, Shandong Agricultural University,Taian 271018,China)

Abstract A male sterile mutant by T-DNA insertion was crossed with a wild type upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivar Coker312.The segregation ratio of male sterile to male fertile was 1∶1 in generation F1.The results of morphological observation, kanamycin and herbicide resistance assay, PCR identification and corresponding genetic analysis showed that the male sterile was co-segregated with the T-DNA insertion.This male sterile mutant was considered as dominant heterozygous mutation caused by the T-DNA insertion,which would lay the basis for cloning the male sterile related genes of upland cotton by T-DNA tagging.

Key wordsUpland cotton;T-DNA;Male sterile mutant;Genetic analysis

在植物的基因克隆和功能分析研究中有许多种策略,利用突变体就是其中之一[1]。产生突变体的方法主要有理化诱变、T-DNA 插入、转座子插入等[2]。其中,农杆菌介导的T-DNA标签法[3]是目前研究植物功能基因组最有效、使用最广泛的手段,据统计有40%的拟南芥突变基因是用T-DNA标签法克隆的[4]。对这些基因的功能研究和利用将为提高作物的产量、品质、抗逆性提供更有效的途径。

棉花是世界上重要的经济作物,提高皮棉产量和纤维品质具有重要的经济效益。目前利用不同品种间的杂交优势是提高皮棉产量和纤维品质的主要手段。但大面积推广的组合,仍然以人工去雄授粉为主,制种成本过高已经成为棉花杂种优势利用的主要限制因素[5]。因此,利用基因工程手段克隆育性相关基因并加以利用创造理想的雄性不育系,就成为提高棉花产量和品质的新途径。

本研究利用野生型Coker312花粉与根癌农杆菌介导T-DNA插入得到的T0代转基因棉花雄性不育突变体杂交,获得F1代植株。在对F1代植株进行育性观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测的基础上,对突变体进行遗传分析,为下一步利用T-DNA标签法[6]克隆与棉花雄性不育相关的基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

野生型陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品系Coker312,T-DNA 插入得到的雄性不育突变体T0代植株。

1.2 育性鉴定

将雄性不育突变体与野生型Coker312杂交得到的F1代以及F1代不育株与Coker312杂交得到的F2代,种植于温室和临清试验田,以野生型Coker312为对照,进行表型观察和数据统计分析。

1.3 卡那霉素和除草剂抗性鉴定

将脱脂棉撕成小条蘸取500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹棉花叶片,5 d后统计抗性植株和非抗性植株比例[7]。同样用脱脂棉条蘸取1%的草甘膦溶液涂抹棉花叶片,统计抗性植株和非抗性植株比例。

1.4 转基因棉花的分子鉴定

按照王芙蓉等[8]改进的CTAB法从棉花叶片中提取总DNA,参照T-DNA上含有的抗草甘膦基因和NPTⅡ基因设计引物,进行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因PCR扩增。引物序列见表1。

表1 用于扩增T-DNA上特异片段的PCR引物序列

引物名称引物序列( 5"-3")

GR-fTTTACAAGTGGCCACCTAGCT

GR-rTGGTTCGTGTCTCATGCACTT

NPTII-fCCTGTCCGGTGCCCTGAATGAAC

NPTII-rCCACACCCAGCCGGCCACAGTCG

2 结果与分析

2.1 雄性不育突变体性状表现

从T-DNA插入株系中获得了一个突变体,该突变体叶片和株高发育正常,但花丝短,柱头较长,花药不开裂,不能正常散粉,进行自交后不结铃。利用Coker312花粉进行人工授粉后结铃并获得种子,说明该突变体柱头发育正常,雄蕊发育异常,属于雄性不育突变体(图1)。对该突变体进行全生育期的观察,雄性不育突变表型在生长发育过程中表现稳定。

A为突变体雄性不育花;B为野生型正常花

图1 T-DNA插入突变体雄性不育表型

2.2 遗传分析

将突变体与野生型Coker312杂交得到的F1代种植于温室和临清试验田,以野生型Coker312为对照,进行表型分析。F1代共41株,19株表现为雄性不育,22株可育,符合1∶1的分离假设(χ2C = 0.220 < χ20.05 = 3.84),据此我们认为该突变类似于显性突变。为验证突变性状的稳定性,将F1代分离出的不育株再授以Coker312的花粉,得到F2代植株共185株,有90株表现雄性不育,95株可育,分离比仍然是1∶1(χ2C = 0.135 < χ20.05 = 3.84),结果与F1代完全一致,进一步证明该突变是显性杂合突变。

2.3 卡那霉素和除草剂抗性鉴定

由于T-DNA区含有抗草甘膦基因和NPTⅡ基因(图2),对卡那霉素和除草剂有抗性,因此可对F1代进行抗性鉴定。用500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹F1代棉花叶片,处理5 d后F1代中19株雄性不育棉花的叶片没有任何斑点,正常生长,显示出明显的抗性;22株可育棉花的叶片处理部位出现黄斑、萎缩。除草剂抗性的表现与卡那霉素鉴定的结果一致。从而证实,突变体植株具有明显的野生型植株所不具备的抗性,卡那霉素和除草剂抗性表现与育性表型一致,表明雄性不育

注:水平箭头示引物的位置

图2 插入到棉花基因组中的T-DNA结构

突变性状与卡那霉素和除草剂抗性基因共分离。

2.4 转基因棉花的分子鉴定

为了从分子水平上验证突变是否与T-DNA插入有关,对F1代中的41株进行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的PCR扩增。利用引物GR-f、GR-r扩增抗草甘膦基因(图3上图);利用引物NPTⅡ-f和NPTⅡ-r扩增NPTⅡ基因(图3下图)。结果表明F1代中,19株不育植株能扩增出一条抗草甘膦的1 199 bp片段和一条NPTⅡ的488 bp片段(图的第1、4泳道);而育性正常的22株植株(如泳道2、3、5)中均无特异性的扩增条带出现。即基因组DNA的PCR扩增结果、卡那霉素和除草剂鉴定结果与棉花育性表型具有一致性。表现为:转基因F1代棉花中有19株雄性不育棉花同时具有卡那霉素和除草剂抗性,并可扩增出抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的特异性片段;22株育性正常棉花不具有卡那霉素和除草剂抗性,也无特异性条带扩增。这也表明雄性不育突变性状与抗草甘膦基因和NPTⅡ基因共分离,即雄性不育突变性状与T-DNA的插入相关,提示该突变体可能含有单个T-DNA插入位点且与T-DNA共分离,因此可以通过T-DNA标签法分离突变基因。为了进一步验证,利用研究得到的T-DNA插入位点的基因组序列设计引物组合,扩增突变体基因组和野生型基因组。如果突变体是纯合体,由于T-DNA的间隔,PCR就不会有

图3 棉花基因组中T-DNA上的抗草甘膦基因(上图) 和NPTII基因(下图)的PCR扩增

扩增产物。结果突变体和野生型得到了相同的扩增结果(结果未显示),并且巢式引物也说明了反应产物是特异性产物,充分说明F1代突变体为杂合体,突变为显性突变。因而,从分子水平证实该突变是显性杂合突变。

3 讨论与结论

突变体是遗传学研究的基本材料,在植物的基因克隆和功能分析研究中有重要作用。T-DNA标签法是研究植物功能基因组最有效、使用最广泛的人工诱导产生突变体的手段,其优点是一旦确定突变性状由T-DNA插入引起, 就可以通过测定T-DNA的旁侧序列而快速分离到相应的突变基因[6]。目前利用不同棉花品种间的杂交优势是实现这一目标的主要手段。但人工去雄、授粉创造杂交组合使得制种成本过高,已成为限制杂种优势利用的主要因素。虽然已从棉花中鉴定出了一些不同类型的雄性不育系,但一直难以在杂交制种中应用[5]。因此,可以利用T-DNA标签法克隆育性相关的基因,研究雄性不育的分子机理,并加以利用,创造理想的棉花雄性不育系类型。

本研究利用T-DNA插入得到雄性不育的T0代突变体,用野生型Coker312花粉与之杂交获得F1代植株。F1代以及F2代植株均出现1∶1的育性分离,与卡那霉素和除草剂抗性鉴定以及PCR检测结果一致,进一步的分子鉴定结果证实突变是由T-DNA插入引起的显性杂合突变,因此可以通过测定T-DNA的旁侧序列而快速分离到相应的突变基因。大多数情况下,雄性不育表型是纯合的隐性基因(ms/ms)造成的,杂合(+/ms)具有正常的花粉。该基因座位可能蕴含了一种新的雄性不育的遗传机制。对该位点及其附近基因的克隆,及其在棉花生殖发育中的功能研究,将有助于更好地了解棉花的生殖发育,为棉花雄性不育机理研究奠定基础,进而可能成为促进杂种优势利用,提高棉花产量和品质的新途径。

参 考 文 献:

[1] Richards S J, Hill A,Hillmen P.Recent advances in the diagnosis, monitoring and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Cytometry B.Clin.Cytom., 2007,

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