叶菌唑与肟菌酯及其复配对葡萄炭疽病菌及白腐病菌的室内抑菌活性及田间防效

计划（编号：NY2018571423）。

作者简介：吉沐祥（1963—），男，江苏宝应人，研究员，主要从事植保农药与果树病虫害绿色防控技术研发。Tel：（0511）80978060;E-mail：jilvdun2800@163.com。

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上产量最大的水果之一，其产量居世界水果第二位[1]。我国是葡萄生产大国，由于大多数葡萄栽培地区连年种植，导致病原菌菌源积累，从而使葡萄炭疽病和白腐病成为葡萄生产上的主要病害[2-3]。葡萄炭疽病主要是由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的。该病菌主要危害叶片，也危害果实、当年生新枝蔓、卷须、叶柄等组织，造成10%～15%产量损失[5-6]。葡萄白腐病是由白腐盾壳霉（Coniella diplodiella）侵染引起的[4]。该病菌侵染迅速，主要危害果穗、枝蔓和叶片，给葡萄生产构成极大威胁[7]。

化学防治仍是当前防治葡萄白腐病和炭疽病的主要手段。目前，防治葡萄白腐病和炭疽病的常用药剂有福美双、代森锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、咪鲜胺、氟硅唑、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和腈菌唑等。有研究表明，由于頻繁使用，这些常用药剂对葡萄炭疽病的防效已显著下降，病菌已对甲基硫菌灵和多菌灵产生抗性[3，8]。因此，须筛选出防治葡萄白腐病和炭疽病的新药剂，通过不同作用机制的杀菌剂轮换交替使用来抑制病菌抗性产生，从而满足生产需求。叶菌唑是由日本吴羽化学公司研发的新款三唑类杀菌剂，是病菌细胞膜的重[HJ1.4mm]要组分麦角甾醇生物合成中C-14脱甲基化酶抑制剂，其杀菌谱广泛，活性高，对非靶标生物低毒[9]。脱甲基化抑制剂杀菌剂是有效控制炭疽病的一种化学类极少见的单位点杀菌剂，叶菌唑对从桃树中分离到的大多数炭疽病菌小种有效[10]，除了C. truncatum小种[11]。肟菌酯是从天然产物[CM（26]β-甲氧基丙烯酸酯衍生物开发的一类新的含氟杀菌剂，具有广谱、高效、低毒等特点[12]。因此，本研究测定叶菌唑、肟菌酯对葡萄炭疽病菌及白腐病菌的室内生物活性以及二者按不同配比复配后的生物活性，并通过田间试验评价2种药剂混用对葡萄炭疽病和白腐病的防治效果，以期为开发防治葡萄白腐病和炭疽病的新药剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata）和白腐病菌（Coniothyrium diplodiella），采自江苏省句容市华阳镇下甸村葡萄园，由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室分离、鉴定并保存备用。菌株保存于马铃薯蔗糖琼脂（PDA）斜面上（4 ℃）。实验室内在PDA培养基平板上转接1次后，于26 ℃条件下预培养3 d，从菌落边缘取直径为5 mm的菌丝块用于测定。

1.1.2 供试药剂

主要试剂有95%叶菌唑原药（江苏辉丰生物农业股份有限公司）、97%肟菌酯原药（江苏耕耘化学有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 药液的配制及浓度设计

母液配制：将叶菌唑原药和肟菌酯原药用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的母液。

炭疽病菌各药剂单剂与复配剂的浓度设计：叶菌唑在含药PDA培养基中的浓度为0.062 5、0. 125、0.25、0.50、1、2 μg/mL;肟菌酯在含药PDA培养基中的浓度为0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL;叶菌唑·肟菌酯（质量比3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）复配剂在含药PDA中的浓度均为0.062 5、0125、0.25、0.5、1、 2 μg/mL。单剂与复配剂的浓度设计均为7个2倍稀释的梯度浓度含药PDA培养基。

白腐病菌各药剂单剂与复配剂的浓度设计：叶菌唑在含药PDA培养基中的浓度为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL;肟菌酯在含药PDA培养基中的浓度为0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL;叶菌唑·肟菌酯（质量比 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）复配剂在含药PDA中的浓度为0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL。单剂与复配剂的浓度设计均为7个2倍稀释的梯度浓度含药PDA培养基。除母液外，所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。

1.2.2 杀菌剂对葡萄炭疽病菌和白腐病菌的室内毒力测定

在温度为25 ℃条件下培养3 d后利用十字交叉法测量各处理菌落直径，以不含杀菌剂的PDA培养基为对照，每处理重复4次。计算出药剂的抑制百分率，按毒力回归方程y=a+bx计算药剂抑制菌丝生长的有效中浓度（EC50）作为毒力参数。

计算公式：抑制生长率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落净生长量-接种菌柄直径）×100%。

1.2.3 杀菌剂对葡萄炭疽病菌和白腐病菌的最佳配比离体试验筛选

采用几率值分析法计算每个杀菌剂对靶标菌菌丝生长的有效抑制中浓度，并通过下面公式计算混合药剂的增效系数（SR）。

式中：a表示药剂A在混合药剂中所占的比例;b表示药剂B在混合药剂中所占的比例;EC50（Obs）为实际测定的混合药剂对病原菌的抑制中浓度;EC50（exp）为混合药剂对病原菌的理论抑制中浓度。通过上面2个公式计算得每个设定比例的配方的SR值，SR>1.5说明2种药剂复配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5说明2种药剂之间复配具有相加作用，SR<0.5 表明2种药剂为拮抗作用[13]。

1.2.4 杀菌剂对葡萄炭疽病和白腐病的田间防效试验

1.2.4.1 试验田概况

试验于2016年在句容市戴家边戴子龙葡萄园进行。葡萄品种为夏黑，栽培方式为棚架，树龄为6年，田间管理水平良好，试药前1周未使用其他农药。

1.2.4.2 试验设计

将肟菌酯、叶菌唑按质量比3 ∶1的比例加工成40%肟菌酯·叶菌唑悬浮剂。试验共设40%肟菌酯·叶菌唑悬浮劑（江苏擎宇化工科技有限公司）1 500、3 000、4 500倍液，10%叶菌唑悬浮剂（江苏辉丰生物农业股份有限公司）1 500倍液，30%肟菌酯悬浮剂（江苏耕耘化学有限公司）1 500倍液，设清水对照6个处理，每个处理4次重复，随机区组排列，每个小区供试3株葡萄树。

1.2.4.3 统计方法

于2016年6月15日，果穗分别用上述药剂浸果处理，药后2 h套袋，果实成熟后摘袋调查果实病害。每个处理随机取5个果穗，调查并记录每穗果粒数和发病果粒数，并计算发病果粒率和果粒防效。

葡萄炭疽病和白腐病以发病果粒率表示各处理的发病情况，结果计算公式：

发病果粒率=发病粒数/调查总果粒数×100%;

防治效果=（对照区病果率-处理区病果率）/对照区病果率×100%。

2 结果与分析

2.1 室内抑菌活性测定

2.1.1 叶菌唑与肟菌酯对葡萄炭疽病病菌和白腐病病菌菌丝生长的抑制作用

由表1可知，叶菌唑与肟菌酯的浓度分别为0.062 5～2 μg/mL和0.25～8 μg/mL时，对葡萄炭疽病抑菌率分别为2.12%～72.73%、17.88%～66.97%。当叶菌唑与肟菌酯的浓度分别为0.062 5～2 μg/mL 和0.312 5～10 μg/mL时，对葡萄白腐病抑菌率分别为5.45%～76.36%、15.76%～72.73%。这表明2种杀菌剂对葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌丝生长的抑制活性以及对葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌丝生长的最低抑制浓度有差异。

2.1.2 叶菌唑与肟菌酯复配对葡萄炭疽病病菌及白腐病菌菌丝生长的抑制作用

由表2可知，叶菌唑与肟菌酯5种混配组合的浓度为0.062 5～2 μg/mL时，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和1 ∶5的配比复配组合对葡萄炭疽病病菌菌丝生长抑菌率分别为18.18%～76.36%、4.24%～72.73%、12.73%～70.91%、14.55%～75.15%、13.94%～71.21%。由表3可知，当叶菌唑与肟菌酯5种混配组合的浓度为 0.156 25～5 μg/mL时，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和 1 ∶5 的配比复配组合对葡萄白腐病病菌菌丝生长抑菌率分别为15.45%～7879%、9.09%～79.39%、19.09%～84.24%、18.18%～83.64%、15.76%～78.18%。

2.1.3 叶菌唑、肟菌酯及其复配剂对葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的毒力测定 2种单剂和5种复配组合对葡萄炭疽病病菌的作用模型如表4所示，浓度对数与防治效果几率值的相关系数均≥0.960 4，说明防治效果几率值的变异有96.04%或以上来自浓度对数的变异，表明用所得模型表达浓度对数与防治效果几率值的关系可行。

由表4可知，叶菌唑、肟菌酯单剂对葡萄炭疽病病菌的EC50分别为0.898 3、3.670 7 μg/mL，叶菌唑对葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制活性高于肟菌酯。叶菌唑、肟菌酯单剂对葡萄白腐病病菌的EC50分别为0.838 6、3.395 5 μg/mL，叶菌唑对葡萄白腐病菌菌丝生长的抑制活性同样也高于肟菌酯（表5）。

根据Wadley评价法，叶菌唑与肟菌酯对炭疽病病菌分别以质量比1 ∶1、1 ∶3、1 ∶2和1 ∶5的复配，增效系数（SR）分别为1.97、3.37、2.62、2.53，增效系数（SR）﹥1.5，表现出增效作用，质量比3 ∶1的复配，增效系数（SR）在0.5～1.5之间，表现出相加作用;叶菌唑与肟菌酯对白腐病病菌分别以质量比1 ∶3和1 ∶2的复配，增效系数（SR）分别为2.05和151，增效系数（SR）﹥1.5，表现出增效作用，质量比3 ∶1、1 ∶1 和 1 ∶5 的复配，增效系数（SR）在0.5～1.5之间，表现出相加作用;因此，叶菌唑和肟菌酯复配对葡萄炭疽病病菌及白腐病病菌的都有较高抑制作用，推荐最佳复配配比为 1 ∶3。其中，叶菌唑 ∶肟菌酯=1 ∶3的增效系数最高;叶菌唑 ∶肟菌酯=3 ∶1的增效系数最低。生产中可根据原药的成本和实际使用效果确定合适的配比。

2.2 田间药效试验

由表6可知，40%肟菌酯·叶菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%叶菌唑1 500倍液、30%肟菌酯1 500倍液，成熟采收时（施药后50 d）对葡萄炭疽病的防治效果分别为53.00%、64.35%、73.85%、68.87%、55.12%，40%肟菌 酯· 叶菌唑1 500倍液对葡萄炭疽病的防治效果极显著高于30%肟菌酯1 500倍液，防治效果高于10%叶菌唑1 500倍液，但未达到显著性差异。由表7可知，40%肟菌酯·叶菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%叶菌唑1 500倍液和30%肟菌酯1 500倍液施药后50 d对葡萄白腐病的防治效果分别为74.29%、82.29%、90.94%、83.52%、59.45%;40%肟菌酯·叶菌唑3 000倍液对葡萄白腐病的防治效果极显著高于30%肟菌酯1 500倍液，与10%叶菌唑1 500倍液防效相当;40%肟菌酯·叶菌唑1 500倍液对葡萄白腐病的防治效果极显著高于30%肟菌酯1 500倍液和10%叶菌唑1 500倍液。

3 结论与讨论

葡萄炭疽病和白腐病是葡萄的主要病害，在我国发生频率较高，目前化学药剂防治仍是葡萄炭疽病和白腐病防治的有效措施。甾醇对维系细胞膜结构，保持真核细胞结构的流动性十分重要[14]，三唑类杀菌剂是一种含有三氮唑的有机杂环类化合物，可通过三唑环上的N-4与真菌细胞色素p-450中的铁卟啉中心的亚铁离子配位，进而抑制其底物的脱甲基化反应，来阻断麦角甾醇的合成，使真菌的细胞膜功能受到破坏，影响真菌菌丝或者是孢子的形成[15]。自第1个三唑类杀菌剂三唑酮面世以来，这类杀菌剂如三唑醇、戊唑醇、烯唑醇、丙环唑、腈菌唑、叶菌唑等陆续被开发，三唑类杀菌剂是现阶段合成种类数最多的麦角甾醇合成抑制剂[14]。目前叶菌唑主要应用于禾本科作物防治白腐病、叶锈病、矮形锈病、颖枯病、黄锈病以及穗镰刀菌、壳针孢菌等引起的病害[16]。陆学云研究发现，40%叶菌唑·戊唑醇水乳剂150 g/hm2对小麦赤霉病田间防效达97.2%[17]。叶菌唑在美国南卡罗来纳州登记为防治桃树病害的药剂[14]，同时在美国被登记为防治苹果白腐病和黑腐病的杀菌剂[18]。本研究发现，叶菌唑单剂对葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的EC50仅为0.898 3、0.838 6 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有广谱性和高杀菌活性的特点，其作用机制是抑制线粒体中的电子传递，破坏ATP的产生，最终导致病菌因失去能量而死。目前，已经商品化的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂主要有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和啶氧菌酯等。肟菌酯主要应用于大豆、谷物、玉米和葡萄等作物。肟菌酯对大多数真菌纲的病害具有良好的活性[19]，针对油菜菌核病其防效优于多菌灵[20]。在美国西瓜炭疽病防治试验中发现，肟菌酯增加了总果实数量和重量，提高了果实可溶性固形物含量，并降低了炭疽病症状的果实比例[21]。解维星等研究发现，30%肟菌酯·苯醚甲环唑水乳剂1 000倍液对黄瓜白粉病的防治效果好，第2次药后 10 d 防效可达92.68%[12]。本研究结果表明，肟菌酯单剂对葡萄炭疽病菌和白腐病菌的EC50分别为3.670 7、3.395 5 μg/mL。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂如肟菌酯、嘧菌酯和吡唑醚菌酯等，如果长期使用，可能会存在一定的抗药性隐患，将其与作用机制不同的其他种类杀菌剂混配可延缓或降低抗药性的发生。不同种类杀菌剂复配产生的增效作用，不仅可以减少杀菌剂的用量，还可以提高杀菌剂的活性，降低农药使用成本，减少对环境的污染[22]。本試验得出，叶菌唑和肟菌酯以质量比 1 ∶3 的比例混合，在离体条件下对葡萄炭疽病和白腐病都具有增效作用，在田间条件下40%肟菌酯·叶菌唑 1 500 倍液对葡萄炭疽病和白腐病的平均果粒防效极显著高于30%肟菌酯1 500倍液，对炭疽病的平均果粒防效与10%叶菌唑 1 500 倍液防效相当，对白腐病的平均果粒防效显著高于10%叶菌唑1 500倍液，本研究结果为40%肟菌酯·叶菌唑 1 500 倍液应用于葡萄炭疽病和白腐病防治提供了依据，可在生产中进一步示范应用。

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