[摘要]蛇类中药饮片具有较高的临床药用价值，具有抗炎、镇痛、通络等功效，药理作用明显。近年来，由于野生动植物资源匮乏、蛇类中药饮片价格昂贵，市场上出现了很多伪品和混淆品。传统的中药饮片鉴别方法包括基源、形态、显微、理化鉴别四大方法体系，但这些方法都存在一些弊端，包括对中药样本有较高的形态学要求、鉴别过程复杂、易受主观因素影响等。随着分子生物学研究的深入和分子遗传标记技术的发展，中药鉴别方法逐渐多元化，一些新兴的理论和技术被引入中药材鉴别领域，RAPD技术、PCR反应、DNA条形码分析等。该文将着重对当前蛇类中药饮片的分子鉴别方法作简要综述。
[关键词]蛇类中药饮片； RAPD； PCR； DNA条形码分析
Progress in molecular identification of snake drugs
XU Yi1， LU Yan1， WU Haiping2， BU Ying2*
（1China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；
2 Institute for Drug and Instrument Control of Joint Logistics Department of Nanjing Military Area
Command， Nanjing 210008， China）
[Abstract]Snake drugs have high values in clinical medication for antiinflammatory， analgesia activities and dredging collaterals However， owing to their deficient resource and substantial profit， many counterfeits for snake drugs have appeared on the market Traditional methods for Chinese medicine authentication include identification of origin， morphology identification， microscopy and physiochemical identification But these methods are restricted in application because of their high morphological requirement for specimens， complex process for assays and indeterminate results guided by subjective With the development of molecular biology and molecular genetic techniques， new theories and technologies for molecular detection have been introduced to the authentication of Chinese medicine， such as RAPD， specific PCR amplification， DNA barcoding analysis and so on， improved the authentication system of Chinese medicine Here， we will give a brief review of molecular detection methods for snake drugs authentication
[Key words]snake drugs； RAPD； PCR； DNA barcoding analysis
中藥是中华民族的伟大瑰宝，蛇类药材来源于药用蛇类的特定部位，是动物类中药材的重要组成部分。蛇类中药饮片产地各异、形态多样、成分复杂、作用靶点多，临床主要用于祛风、通络、止痉等。但是，市场上层出不穷的仿冒品对人民群众的用药安全构成了威胁，因此对其进行准确鉴别是当前对蛇类中药饮片质量控制的首要前提。随着现代科学技术的发展，中药鉴别逐渐形成了基源、形态、显微、理化四大方法体系。显微和理化鉴别是借助现代化仪器对药材的微观形态特征和主要有效成分进行分析，从而达到鉴别的目的。现代化分析技术既是对经验性鉴别方法的补充，也是对其科学的诠释，不过这些方法也受到主观判断和环境变化的影响，仅凭有效成分不能准确鉴别药材。中药材不同于合成药物，尤其是来源于动植物的药材，虽然通过了多项炮制工艺，但是药用部位的DNA依然保存完整。鉴别药材特有的DNA序列将从根本上确定药材的真伪。2010年版《中国药典》收入乌梢蛇Zaocys dhumnades、蕲蛇Agkistrodon acutus的PCR鉴别方法，明确了分子鉴别技术在蛇类药材鉴别领域的作用。但是该方法存在目的基因单一、开管易污染、特异性差等缺点。本文通过回顾蛇类中药饮片分子鉴别研究的发展历程，希望对完善蛇类药材的分子鉴别方法有所启示。
1基于随机引物扩增的RAPD技术
RAPD技术（random amplified polymorphism，RAPD）以PCR为基础，以人工合成的大约10 nt的寡核苷酸单链作为随机引物。随机引物的退火温度一般为36 ℃，既能与目的序列相互结合，又能保证一定的错粘，扩大了DNA的检测区域。待测模板上结合位点的突变将直接导致其PCR产物的改变。分析PCR产物在电泳图上的分布，可从中获得全基因组多态性的信息，这对后续如基因指纹图谱[1]、动植物育种[2]、基因定位[3]、物种亲缘关系的建立[4]等研究具有理论和实践指导意义。
目前，基因指纹图谱是对中药材进行质控的重要方法，RAPD技术可实现理想的分子标记。待测样品经随机引物扩增后，其PCR产物在凝胶电泳上可呈现出物种特有的DNA指纹图谱。研究者通过直接对比待测样品和标准品的DNA指纹图谱，即可鉴别药材的真伪。如通过基因组DNA电泳图谱和标准图谱的比对分析，对金钱白花蛇和乌梢蛇的混伪品具有良好的鉴别效果[5]。目前RAPD技术已经成功地运用于多种中药材以及其他动植物的遗传多样性分析和品种的鉴别中。RAPD技术在物种遗传多样性研究中，结合生物统计学，可实现物种的种属划分，达到鉴别的目的。如王义权等运用该技术研究了蛇类的种属亲缘关系[6]。
RAPD技术的优点在于：①模板用量少，无需酶切、产物转移、探针杂交等繁琐的操作，简单易行；②含多个随机引物，标记的分子DNA序列多，可实现全基因组多态性分析；③实验条件没有严格的限制，如无需同位素标记、特异性引物设计。但是，近几年RAPD技术的研究逐渐减少，研究者鲜有单独使用RAPD技术研究物种DNA分子多态性。究其原因主要是该技术存在判定标准不同、有序列同源的干扰[7]、实验结果不具稳定性、重复性差[8]等不足。
综合以上原因使RAPD的单独使用受到了严重的限制。因此，寻找特异性的基因，增加实验的稳定性和重复性，将是蛇类中药饮片分子鉴别的新方向。
2基于特异性引物扩增的DNA序列分析
在蛇类药材的分子鉴别研究中，研究者发现了12S rRNA和Cytb这2个理想的保守基因，可应用特异性PCR扩增技术对其进行扩增检测，以鉴别蛇类中药饮片的真伪。
21基于线粒体12S rRNA基因序列的鉴别研究12S rRNA存在于线粒体基因组DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上，是一种核糖体RNA。作为核外DNA，12S rRNA具有母系遗传、足够的变异、结构简单、无重组等特点。该序列在不同的物种间差异大，而在同一物种内又具有足够的保守性。因此，可针对该基因序列设计特异性的引物，优化实验条件，最终，以产物在电泳中是否出现目的条带判断正伪。
对于蛇类中药饮片的鉴别，2010年版《中国药典》收入的乌梢蛇是基于12S rRNA的特异性PCR扩增方法，说明该序列特异性明显。基于12S rRNA的鉴别研究发现种内差异对鉴别无影响[9]。12S rRNA序列还可以用于测序鉴别研究，不仅能鉴别乌梢蛇的正伪品，而且可以获得待测样本的种属关系[10]。
目前12S rRNA基因主要作为物种系统进化以及亲缘关系的分子标记，除了蛇类研究以外，种属关系研究较为广泛和成熟的动物还有龟甲类、鸟类、蛙类、鱼类[1114]等，并且都取得了显著的成绩。
22基于Cytb基因序列的鉴别研究Cytb是编码线粒体内细胞色素b氧化酶亚基基因，与12S rRNA同为理想的基因标记位点：严格的母系遗传，与核基因组DNA无共同序列，没有基因重组现象。因此该基因在研究基因进化、物种亲缘关系和物种的鉴定[1516]等方面同样具有重要意义。在蛇类中药饮片的鉴别中，可使用经典的Cytb通用引物扩增相关蛇类的目的序列并测序。在中药蛇类与混伪品的研究中发现，Cytb基因在同种蛇类中序列差别小，而在不同种蛇类中序列差别大[1718]，说明蛇类Cytb基因是一种理想的分子标记。如果能设计高特异性的引物，优化反应条件如退火温度、酶的活性、反应循环数等，不仅可以在种间高效地区分正伪，也能在序列差异较小的种内准确鉴别。以Cytb基因作为分子标记对银环蛇目的序列进行特异性PCR扩增，可快速有效地鉴别银环蛇来源的金钱白花蛇[19]，即使在多重PCR扩增体系中，特异性的引物也能稳定扩增金钱白花蛇的目的序列，在其常见的伪品赤链蛇、赤练华游蛇、金环蛇中做出准确的鉴别[20]。
虽然基于Cytb基因和12S rRNA基因的物种DNA序列研究日趋完善，但是基于特异性引物扩增的方法在蛇类鉴别中还存在一些不足：①在不同种蛇类研究中，PCR实验条件的摸索时间较长，成本高，且不容易转向实际应用；②动物类药材不同于植物药材，不会固定生长，不同地区的同一个物种也可能因为环境、气候、地理等原因在序列上存在差异。因此需要收集多个标准品进行对比[9]；③分子鉴别方法自身的不足。对于特殊的蛇类中药饮片如金钱白花蛇[19]，其药用基原是银环蛇的幼蛇，如有成蛇混在正品中，此方法将无法进行区分。在实际的鉴别工作中，单考虑某个线粒体基因并不能充分鉴别一个物种，需要结合其他基因位点，并且需要联合形态学和理化特征研究，才能准确鉴别。
3基于通用引物扩增的DNA序列条形码分析
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术。近年来，基于DNA条形码的序列扩增方法在物种鉴别领域中得到了快速的发展和应用，广泛应用于动植物的鉴定和鉴别中，如昆虫类[21]、鸟类[22]、鱼类[2324]、蛇类[25]等，在物种保护、生物安全、生物多样性研究等方面具有重要意义。
DNA条形码技术操作简便、结果准确、易于推广。动物类中藥材采用的序列鉴定以细胞色素C氧化亚酶I基因（cytochrome C oxidase subanit Ⅰ gene，COⅠ）为主，以内部转录间隔区2（internal transcribed spacer，ITS2）为辅。COⅠ基因具有高度保守、插入和缺失较少、能够被通用引物扩增等优点，相比同为编码蛋白的Cytb基因，其通用引物的普适性更强；而与12S rRNA序列相比，该基因片段插入和缺失更少，序列相对简单，进化速度快，在亲缘关系密切的物种鉴别中具有独特的优势。
基于COⅠ条形码的分子鉴别，由于可以使用通用引物扩增、获取未知的目的序列，所以可以使用计算机软件，将扩增的序列进行测序、序列比对和遗传距离分析，并构建系统分支树，从聚类图中获得物种的种属关系；同时也可建立COⅠ数据库，最后进行品种鉴定。这也为蛇类中药饮片的鉴别提供了定性的方法，COⅠ条形码技术能够区分亲缘关系极为接近的乌梢蛇和灰鼠蛇[26]，金钱白花蛇及其混伪品[27]，相比于其他分子标记方法准确性更高。基于COⅠ条形码的分子鉴别研究已经显现出强大的应用前景，2015年版《中国药典》已经收入记载了中药材分子鉴定法指导原则。
综上所述，DNA条形码技术在物种分子鉴别领域发展迅速，对于物种亲缘关系和遗传多样性的研究相比于其他线粒体DNA分子标记物准确性更高，包含的遗传信息更多。但是仍然存在不足之处：①不能用于混合物鉴别；②中药材炮制过程中，硫磺熏蒸对DNA检测存在干扰；③同一物种若存在种内变异，如何确定种内阈值是个难题[28]；④mtDNA中假基因的存在容易产生旁系同源扩增，干扰结果判断[29]。
4其他分子检测方法
以上3种分子鉴别方法根据靶序列性质的不同，分别采用随机引物、特异性引物、通用引物进行PCR扩增，但它们最后都通过凝胶电泳进行检测。虽然凝胶电泳是常见的核酸分离方法，但是在实际操作中需要开管取样，易产生交叉污染，且耗时长，增加了分子检测的时间和人工成本。实时荧光PCR检测方法虽然可实现闭管无污染的检测[30]，但仪器昂贵、技术要求高，限制了其在基层单位的应用。近几年，随着材料学的发展，可视化的检测方法引起了研究者的兴趣，其中最为典型的是基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的阳离子高分子聚合物（cationic conjugated polyelectrolytes，CCP）[31]，目前，已有文献报道将CCP用于蛇类中药饮片的正伪鉴别中。水溶性的CCP可与带负电荷的DNA链结合，在紫外光激发下，吸收光能量而显色。若PCR产物中存在靶序列，CCP与之结合后，能量将传递至DNA链上修饰了荧光基团的dUTP（fluoresceinlabeled dUTP，FdUTP）上。而CCP自身的能量降低，波长红移，指示颜色发生变化。FdUTP作为DNA链合成的原料出现在目的PCR产物中，而引物二聚体较短，即使含有少量的FdUTP，也不能引起CCP的颜色变化，因此无假阳性干扰。研究者已经对蛇类样本联合运用特异性PCR扩增和CCPFRET进行检测，证明该检测方法操作简单、灵敏度高，在紫外下可实现可视化检测，且检测结果与基因测序比对结果一致，具有高度准确性[32]。基于以上叙述，有理由相信分子生物学与材料学、物理学乃至更多的学科之间相互交叉融合、优势互补，可促进中药材鉴别学的快速发展。
5展望
我国中药资源丰富，中药市场潜力巨大，中药材的准确鉴别是中药标准化和现代化的第一步。动物类药材携带有自身特有的DNA序列，为分子鉴别奠定了生物学基础。随着分子生物学研究的不断深入，DNA序列分析也将实现科学化与规范化。如何在实际运用中发挥它的优势、完善不足是接下来的研究目标，相信分子生物学的不断进步也将为蛇类中药饮片鉴别领域的发展带来新的突破，为中药市场的繁荣和稳定做出贡献。
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[责任编辑吕冬梅]